本文由通讯作者*华艺教授授权发布，原文发表于JMolDiagnThr,March,Vol.8No.2
遗传性结直肠癌是一类多因素遗传特征家族性疾病，包括Lynch综合征、家族结直肠腺瘤性息肉和MYH相关性息肉，约占所有结直肠癌的5%。Lynch综合征(又称遗传性非息肉性结直肠癌)是因无效的错误配对修复(Mismatchrpair，MMR)而导致微卫星不稳定性(Microsatllitinstability，MSI)的一系列相关癌症，常由MMR基因(MLH1、MSH2、MSH6和PMS2)突变引起。家族性结直肠腺瘤性息肉(Familialadnomatouspolyposis，FAP)是APC基因突变引起的广泛性结肠息肉病。而MUTYH基因突变可引起MYH相关性息肉(MYH-associatdpolyposis，MAP)。为了规范对遗传性结直肠癌的分子诊断技术流程，美国医学遗传学和基因组学会制定检测大纲以供各相关实验室参考。本文对该大纲进行归纳并结合我国的大纲进行讨论。
结直肠癌(colorctalcancr，CRC)可分为散发性、家族性或遗传性2种特征。约20%~30%CRC为多因素遗传特征家族性疾病，因遗传获得的高度外显率单基因突变约占所有CRC的5%。Lynch综合征、家族结直肠腺瘤性息肉（familialadnomatouspolyposis，FAP）和MYH相关性息肉(MYH-associatdpolyposis，MAP)为3种常见遗传性CRC，约占所有CRC的5%。随着分子诊断技术水平的发展和测序成本的降低，遗传性CRC基因的临床检测发展迅速。为帮助临床发现和确诊遗传性CRC患者群体，美国医学遗传和基因组学会(AmricanCollgofMdicalGnticsandGnomics，ACMG)与美国病理学家学会(CollgofAmricanPathologists，CAP)于年发布了遗传性结直肠癌基因诊断技术标准和大纲［1］。本文就指南中遗传性CRC突变基因的检测策略、方法、结果解释进行概括，并结合我国的相关标准进行讨论。
1Lynch综合征的基因检测
Lynch综合征为遗传性CRC的常见类型，占所有CRC的3%，常伴其他肿瘤且80%的病例可发展成CRC，平均发病年龄为61岁，为常染色体显性遗传。多数患者自父母获得某个突变的错误配对修复基因(mismatchrpair，MMR)［2］。MMR蛋白在细胞周期调控和遗传物质维护中发挥重要作用，MMR缺失或缺陷导致组织特异性肿瘤的易感性大大增加。MMR基因(MLH1、MSH2、MSH6和PMS2)突变为常见的4种致病基因，其他基因(PMS1、TGFBR2、MLH3、EpCAM、BRAF)突变也可见，任何一种MMR基因缺失均可导致Lynch综合征。在肿瘤组织中，MMRs基因突变导致高频微卫星不稳定性(microsatllitinstability，MSI)3］。但有MMR基因突变的易感个体，可能终身都不会患CRC。
MMR基因突变可发生于任何种族，4种基因中有多达多种不同突变类型，其中MLH1基因个、MSH2基因个、MSH6基因个、PMS2基因个。突变类型有错义、无义、剪接位点或调节类型。大片段缺失分别占MLH1和MSH2突变的5%~10%和17%~50%。鲜见MSH6和PMS2大片段缺失和重复，未发现突变热点。我国对MMR基因的突变情况也有报道。聂辰等［4对北京地区94例结直肠癌患者的组织标本研究发现遗传性非息肉病性结直肠癌(Lynch综合征)的发病率为13.83%，MSH2基因突变所占比例达84.62%，与遗传性非息肉病性结直肠癌国际合作组织提供的数据(40%)相比高于世界每年新发病例的水平，且MSH2基因突变致病尤为突出。刘晓红等［5］对例连续的结直肠癌患者进行Lynch综合征的初步筛查，结果发现9%的病例出现MMR蛋白缺失表达，以MLH1和MSH2蛋白缺失表达为主，1例患者存在BRAF突变。
1.1检测标准
ACMG制定的检测标准为符合以下任何一项者，需进行MSI检测：
1）50岁以下CRC患者；
2）同时或异时CRC或有其它遗传性非息肉CRC相关肿瘤；
3）60岁以下CRC患者，伴肿瘤浸润淋巴细胞；
4）CRC及一代亲属中有50岁以下CRC或遗传性非息肉病变CRC相关肿瘤诊断史；
5）CRC且2个一代或二代亲属中有50岁以下CRC或遗传性非息肉病变CRC相关肿瘤诊断史。
我国于年发布了中国人遗传性大肠癌的筛检标准［6］：
家系中至少有2例组织病理学明确诊断的CRC，其中的2例为父母与子女或同胞兄弟姐妹的关系，并且符合以下一条：
1）至少1例为多发性大肠癌患者(包括腺瘤)；
2）至少1例大肠癌发病早于50岁；
3）家系中至少1人患遗传性非息肉病性结直肠癌(hrditarynonpolyposiscolorctalcancr，HNPCC)相关肠外恶性肿瘤(包括胃癌、子宫内膜癌、小肠癌、输尿管或肾盂癌、卵巢癌、肝胆系统癌)。
相比之下，ACMG的筛检范围更广泛，减少漏诊的可能性。
1.2检测策略
年我国遗传性大肠癌协作组制定的筛查策略制定了中国人HNPCC家系筛查标准［6］：在实验室条件允许的情况下，符合中国人HNPCC筛检标准的家系均应该进行hMLH1、hMSH2基因的免疫组织化学研究和MSI检测。两者均阴者，可无需进行突变检测分析；两者之一为阳性者，则需进入下一步的hMLH1和hMSH2基因种系突变(grmlinmutation)检测分析。而ACMG推荐的检测策略更为详细、实用，流程如下图］所示。
ACMG推荐，高度怀疑为Lynch综合症患者需做MMR蛋白免疫组(immunohistochmistry，IHC)染色和MSI分析。
（1）如果检测结果提示微卫星稳定或低频率微卫星不稳定，且IHC检测结果为有MMR蛋白表达，则无Lynch综合征。
（2）如果检测结果提示高频率微卫星不稳定，IHC结果为MLH1或PMS2缺失，则进行MLH1启动子“C区”的甲基化分析与BRAF基因突变p.VE检测［7］。BRAF基因突变p.VE多见于散发性CRC，罕见于Lynch综合征肿瘤患者［8］。因此，如检测到MLH1高甲基化和BRAF突变，则认为是散发性CRC，无需家系分析。如检测结果提示MLH1有高甲基化，但无BRAF突变，正常组织里无高甲基化，则CRC为非MMR缺陷引起；如果正常组织中存在高甲基化，则为遗传性表观突变。如检测结果提示MLH1甲基化正常且无BRAF突变，进一步进行MLH1基因突变检测，如检测到突变则为Lynch综合征，需进行家系分析；如无MLH1基因突变，则再进行PMS2基因检测，有突变则为Lynch综合征，需家系分析，无突变则为Lynch综合征携带未经确认的突变。
（3）如果检测结果提示高频率微卫星不稳定，IHC结果提示MLH2缺失，或MSH6单一缺失或MSH2/MSH6双缺失，则进一步进行MSH2基因突变检测，如有突变则为Lynch综合征，需家系分析；如无突变则进行EpCAM缺失检测，如有突变则为Lynch综合征，需家系分析；无突变者则再进行MSH6基因突变检测，如有突变则为Lynch综合征，需家系分析；无突变则为Lynch综合征携带未经确认的突变。
1.3MMR基因突变检测方法
ACMG规定，检测样本应同时包含肿瘤和正常组织，新鲜冰冻或石蜡包埋的组织均适用。组织切片先行HE染色以辨别正常和肿瘤组织的边界再进行IHC检测。肿瘤组织提取的DNA用于MSI检测，血液中提取的DNA可作为正常对照。除PMS2基因外，可用石蜡包埋的组织提取的DNA进行MMR基因突变分析。从病人血液中提取的DNA用于测序分析。
1.3.1MMR蛋白IHC检测
IHC适用于所有4种MMR基因表达产物分析并应同时对其进行检测。观察MMR基因蛋白在细胞核和邻近非肿瘤组织中的表达情况，结果以MMR基因蛋白存在(阳性)或缺失(阴性)表示。这与我国的标准的模式不同，即把缺失表达MMR蛋白的定为阳性结果，正常表达MMR蛋白的定为阴性结果。
1.3.2MSI检测方法
用PCR检测MSI，可使用美国国立癌症研究所(NationalCancrInstitut，NCI)的微卫星重复序列组套BAT25、BAT26、D2S、D17S和D5S。不建议用BAT26评估Lynch综合征高危人群，因为BAT26稳定性也见于Lynch综合征微卫星不稳定性肿瘤中，特别是大片段MSH2缺失。BAT25和BAT26可在同一基因座上呈多态性，因此归类为MSI阳性并不正确。
1.3.3MMR基因的突变检测
MMR基因突变分子检测为Lynch综合征的确诊方法。
我国年大纲推荐用聚合酶链反应单链构象多态(polymraschainraction-singlstrandconformationpolymorphism，PCR-SSCP)或变性高效液相色谱分析(dnaturinghighprformancliquidchromatography，DHPLC)法，或直接进行DNA序列测定。如上述方法检测结果阴性，需考虑大片段缺失的检测。
ACMG推荐PCR法检测MMR点突变，数套引物、PCR条件以及分离检测方法详见文献［1］。db-SNP数据库建立及0基因组突变数据库定期更新人类基因组SNPs。实验室应每年在最低引物量的情况下检测SNPs的出现情况。
用靶向突变检测技术检测BRAF基因p.VE错义突变，如限制酶切技术、等位基因特异性引物延伸技术，或实时荧光定量PCR。用改良重亚硫酸盐处理结合甲基化特异荧光定量PCR，分析MLH1启动C区甲基化，检测甲基化和非甲基化基因座。
Sangr测序是对MMR基因的所有编码外显子进行突变检测的金标准，在PMS2突变检测时可用功能基因特异引物长链PCR来克服假基因的干扰。下一代测序(Nxtgnrationsquncing，NGS)可高通量、低成本地对CRC相关基因进行测序，但PMS2因假基因存在不能用NGS测序。NGS无法检测所有目的区(如外显子缺失或重复)，只能用Sangr测序和其它方法弥补。对NGS中临床意义未明的序列变异，遵循ACMG对序列变异的解释。家系研究可阐明错义突变属病理性或良性特征。
检测大片段缺失的主要方法为Southrnblot和多重连接依赖的探针扩增技术(multiplxligation-dpndntprobamplification，MLPA)。MLPA可有效检测2个或多个连续外显子缺失，通过一个缺失外显子可推断其他外显子缺失。若MLPA是初始方法，则Southrnblot或实时定量PCR法作为确认方法。其它检测大基因重排的方法包括多重扩增探针杂交法和实时定量PCR。
基因靶向的基于阵列比较基因组杂交技术(array-bas