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基本信息
论文题目：Genome-wideDNAmethylationanalysisbyMethylRadandthetranscriptomeprofilesrevealthepotentialcancer-relatedlncRNAsincoloncance
发表期刊：CancerMedicine（IF：3.）
作者单位：医院
运用生物技术：MethylRAD甲基化检测技术
研究背景
结直肠癌是全球第三大常见恶性肿瘤，也是导致死亡的主要癌症之一。世界卫生组织预测，到年，结直肠癌病例将大幅增加，与结直肠癌相关的死亡率会增加到80%。表观遗传变化（特别是DNA甲基化）在结直肠癌的发生、发展和转移中起到重要作用。DNA甲基化不仅调节蛋白编码基因的表达，而且还影响非编码RNA的表达。非编码RNA（包括miRNA、lncRNA等）作为关键基因表达的重要调控因子，在许多结直肠癌相关通路中发挥作用。但是，lncRNA的甲基化调控作用仍不清楚。
研究内容
本研究通过甲基化和转录组联合分析鉴定和结直肠癌相关的lncRNA。首先，通过MethylRAD技术对5名结肠癌患者的肿瘤组织和癌旁组织进行甲基化试验，检测差异甲基化位点（DMSs）和差异甲基化基因（DMGs）。然后从TCGA数据库下载结直肠癌的转录组数据，分析差异表达的lncRNA。通过甲基化和转录组联合分析，确定了15个与结肠癌相关的lncRNA。最后，通过RT-qPCR和焦磷酸测序验证了15个lncRNA的基因表达和甲基化水平。
研究结果
1.甲基化位点在不同功能元件和不同基因区域的分布
从全基因组序列中提取含有CCGG或CCWGG位点的序列作为参考序列，然后将每个样品的EnzymeReads比对到参考序列上，只有测序深度大于3X的位点被认为是可靠的甲基化位点。图1A和图1B为每个样品中不同基因功能元件上甲基化位点的分布，结果表明，CCGG和CCWGG甲基化位点主要分布在内含子和基因间区。
2.甲基化位点的相对定量
本研究共检测到个CCGG和个CCWGG甲基化位点，其中，个CCGG和个CCWGG位点为差异甲基化位点。差异甲基化位点在染色体上的分布是不均匀的（图1C、1D），主要分布在内含子和基因间区（图1E、1F）。
图1甲基化位点的分布。(A)CCGG位点在不同基因功能元件上的分布；(B)CCWGG位点在不同基因功能元件上的分布；(C)CCGG位点在不同染色体上的分布；(D)CCWGG位点在不同染色体上的分布；(E)CCGG位点在不同功能元件上的比例；(F)CCWGG位点在不同功能元件上的比例。
3.lncRNA差异甲基化位点的鉴定
根据GENCODE注释结果，有个CCGG和个CCWGG差异甲基化位点属于lncRNA。把CCGG和CCWGG位点合并，去掉92个重复差异甲基化位点，最后得到个lncRNA差异甲基化位点。选取前个lncRNA差异甲基化位点进行聚类分析（图2A），结果显示肿瘤组织甲基化位点的水平更高，lncRNA差异甲基化位点可以很好地区分肿瘤和癌旁组织，5对肿瘤组织与癌旁组织均能正确分开。
4.lncRNA差异甲基化基因的鉴定
本研究共获得个CCGG和个CCWGG差异甲基化基因。这些差异甲基化基因被重新划分为6种基因类型（图2B）。CCGG差异甲基化基因中有个lncRNA基因(37.5%)和个假基因(31%)；CCWGG差异甲基化基因中有个lncRNA基因(44.3%)和个蛋白编码基因(42.7%)。该结果表明，lncRNA基因在CCGG和CCWGG差异甲基化基因的出现频率均较高。最后，我们鉴定了个lncRNA差异甲基化基因，用于与TCGA转录组测序数据联合分析。
图2差异甲基化位点聚类分析和分类。(A)肿瘤组织与癌旁组织前个lncRNA差异甲基化位点的热图；(B)差异甲基化基因在6种不同类型基因的比例。
5.TCGA数据库中差异表达的lncRNA的鉴定
从TCGA数据库下载例结直肠癌患者和41例对照的转录组测序数据，共获得个差异表达基因。其中，个差异表达基因为lncRNA。
6.结直肠癌相关lncRNA的鉴定
通过对lncRNA差异甲基化基因和lncRNA差异表达基因进行Venn分析（图3），最终发现15个可能与结直肠癌相关的lncRNA。其中，2个lncRNA（ZNF-AS1和MAFA-AS1）为高甲基化且基因表达下调，13个lncRNA为低甲基化且基因表达上调。
图3Venn分析MethylRAD检测到的lncRNA差异甲基化基因和TCGA数据库检测到的差异表达的lncRNA基因。
7.结直肠癌相关lncRNA的功能富集分析
采用LncRN2Targetv2.0和StarBase分析与15个lncRNA共表达的蛋白编码基因，其中lncRNAHULC和ZNF-AS1分别鉴定到28个、9个共表达的蛋白编码基因（表1）。
表1与lncRNAZNF-AS1和HULC共表达的蛋白编码基因
8.lncRNA-miRNA相互作用的预测
通过DIANA‐LncBaseexperimentalv.2预测lncRNA-miRNA相互作用，分别有6个、7个miRNAs可以与lncRNAZNF-AS1和HULC相结合；然后通过免疫沉淀（IP）、报告基因检测（RP）或qPCR（qP）验证了它们的相互作用（表2）。
表2与lncRNAZNF-AS1和HULC相结合的miRNAs
9.结直肠癌相关lncRNA基因表达水平和甲基化水平的验证
本研究采用RT-qPCR和焦磷酸测序检测了15个与结直肠癌相关lncRNA的基因表达水平和甲基化水平。在肿瘤组织中，ZNF-AS1和MAFA-AS1高甲基化且基因表达下调；另外13个lncRNA在肿瘤组织中低甲基化且基因表达上调，与MethylRAD结果相吻合。
图4通过RT-qPCR(A)和焦磷酸测序(B)分别检测20例肿瘤组织和癌旁组织中lncRNA的基因表达水平和甲基化水平。
研究结论
通过MethylRAD甲基化和TCGA转录组分析，鉴定了15个与结直肠癌相关的lncRNA。其中ZNF-AS1和MAFA-AS1在结直肠癌中是高甲基化和低表达，另外13个lncRNAs是低甲基化和高表达。这些lncRNA可能参与肿瘤的发生和进展，本研究为结直肠癌诊断提供了有用的标志物和分子机制的新见解。
参考文献
ZhengG,ZhangY,WangH,etal.Genome-wideDNAmethylationanalysisbyMethylRadandthetranscriptomeprofilesrevealthepotentialcancer-relatedlncRNAsincoloncancer.CancerMedicine,,9(20):-.
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