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基本信息
论文题目：Genome-wideDNAmethylationanalysisbyMethylRadandthetranscriptomeprofilesrevealthepotentialcancer-relatedlncRNAsincoloncance
发表期刊：CancerMedicine（IF：3.）
作者单位：医院
运用生物技术：MethylRAD甲基化检测技术
研究背景
结直肠癌是全球第三大常见恶性肿瘤，也是导致死亡的主要癌症之一。世界卫生组织预测，到年，结直肠癌病例将大幅增加，与结直肠癌相关的死亡率会增加到80%。表观遗传变化（特别是DNA甲基化）在结直肠癌的发生、发展和转移中起到重要作用。DNA甲基化不仅调节蛋白编码基因的表达，而且还影响非编码RNA的表达。非编码RNA（包括miRNA、lncRNA等）作为关键基因表达的重要调控因子，在许多结直肠癌相关通路中发挥作用。但是，lncRNA的甲基化调控作用仍不清楚。
研究内容
本研究通过甲基化和转录组联合分析鉴定和结直肠癌相关的lncRNA。首先，通过MethylRAD技术对5名结肠癌患者的肿瘤组织和癌旁组织进行甲基化试验，检测差异甲基化位点（DMSs）和差异甲基化基因（DMGs）。然后从TCGA数据库下载结直肠癌的转录组数据，分析差异表达的lncRNA。通过甲基化和转录组联合分析，确定了15个与结肠癌相关的lncRNA。最后，通过RT-qPCR和焦磷酸测序验证了15个lncRNA的基因表达和甲基化水平。
研究结果
1.甲基化位点在不同功能元件和不同基因区域的分布
从全基因组序列中提取含有CCGG或CCWGG位点的序列作为参考序列，然后将每个样品的EnzymeReads比对到参考序列上，只有测序深度大于3X的位点被认为是可靠的甲基化位点。图1A和图1B为每个样品中不同基因功能元件上甲基化位点的分布，结果表明，CCGG和CCWGG甲基化位点主要分布在内含子和基因间区。
2.甲基化位点的相对定量
本研究共检测到个CCGG和个CCWGG甲基化位点，其中，个CCGG和个CCWGG位点为差异甲基化位点。差异甲基化位点在染色体上的分布是不均匀的（图1C、1D），主要分布在内含子和基因间区（图1E、1F）。
图1甲基化位点的分布。(A)CCGG位点在不同基因功能元件上的分布；(B)CCWGG位点在不同基因功能元件上的分布；(C)CCGG位点在不同染色体上的分布；(D)CCWGG位点在不同染色体上的分布；(E)CCGG位点在不同功能元件上的比例；(F)CCWGG位点在不同功能元件上的比例。3.lncRNA差异甲基化位点的鉴定
根据GENCODE注释结果，有个CCGG和个CCWGG差异甲基化位点属于lncRNA。把CCGG和CCWGG位点合并，去掉92个重复差异甲基化位点，最后得到个lncRNA差异甲基化位点。选取前个lncRNA差异甲基化位点进行聚类分析（图2A），结果显示肿瘤组织甲基化位点的水平更高，lncRNA差异甲基化位点可以很好地区分肿瘤和癌旁组织，5对肿瘤组织与癌旁组织均能正确分开。
4.lncRNA差异甲基化基因的鉴定
本研究共获得个CCGG和个CCWGG差异甲基化基因。这些差异甲基化基因被重新划分为6种基因类型（图2B）。CCGG差异甲基化基因中有个lncRNA基因(37.5%)和个假基因(31%)；CCWGG差异甲基化基因中有个lncRNA基因(44.3%)和个蛋白编码基因(42.7%)。该结果表明，lncRNA基因在CCGG和CCWGG差异甲基化基因的出现频率均较高。最后，我们鉴定了个lncRNA差异甲基化基因，用于与TCGA转录组测序数据联合分析。
图2差异甲基化位点聚类分析和分类。(A)肿瘤组织与癌旁组织前个lncRNA差异甲基化位点的热图；(B)差异甲基化基因在6种不同类型基因的比例。5.TCGA数据库中差异表达的lncRNA的鉴定
从TCGA数据库下载例结直肠癌患者和41例对照的转录组测序数据，共获得个差异表达基因。其中，个差异表达基因为lncRNA。
6.结直肠癌相关lncRNA的鉴定
通过对lncRNA差异甲基化基因和lncRNA差异表达基因进行Venn分析（图3），最终发现15个可能与结直肠癌相关的lncRNA。其中，2个lncRNA（ZNF-AS1和MAFA-AS1）为高甲基化且基因表达下调，13个lncRNA为低甲基化且基因表达上调。
图3Venn分析MethylRAD检测到的lncRNA差异甲基化基因和TCGA数据库检测到的差异表达的lncRNA基因。7.结直肠癌相关lncRNA的功能富集分析
采用LncRN2Targetv2.0和StarBase分析与15个lncRNA共表达的蛋白编码基因，其中lncRNAHULC和ZNF-AS1分别鉴定到28个、9个共表达的蛋白编码基因（表1）。
表1与lncRNAZNF-AS1和HULC共表达的蛋白编码基因
8.lncRNA-miRNA相互作用的预测
通过DIANA‐LncBaseexperimentalv.2预测lncRNA-miRNA相互作用，分别有6个、7个miRNAs可以与lncRNAZNF-AS1和HULC相结合；然后通过免疫沉淀（IP）、报告基因检测（RP）或qPCR（qP）验证了它们的相互作用（表2）。
表2与lncRNAZNF-AS1和HULC相结合的miRNAs
9.结直肠癌相关lncRNA基因表达水平和甲基化水平的验证
本研究采用RT-qPCR和焦磷酸测序检测了15个与结直肠癌相关lncRNA的基因表达水平和甲基化水平。在肿瘤组织中，ZNF-AS1和MAFA-AS1高甲基化且基因表达下调；另外13个lncRNA在肿瘤组织中低甲基化且基因表达上调，与MethylRAD结果相吻合。
图4通过RT-qPCR(A)和焦磷酸测序(B)分别检测20例肿瘤组织和癌旁组织中lncRNA的基因表达水平和甲基化水平。研究结论
通过MethylRAD甲基化和TCGA转录组分析，鉴定了15个与结直肠癌相关的lncRNA。其中ZNF-AS1和MAFA-AS1在结直肠癌中是高甲基化和低表达，另外13个lncRNAs是低甲基化和高表达。这些lncRNA可能参与肿瘤的发生和进展，本研究为结直肠癌诊断提供了有用的标志物和分子机制的新见解。
参考文献
ZhengG,ZhangY,WangH,etal.Genome-wideDNAmethylationanalysisbyMethylRadandthetranscriptomeprofilesrevealthepotentialcancer-relatedlncRNAsincoloncancer.CancerMedicine,,9(20):-.END
青岛欧易撰文本文系欧易生物原创欢迎转发到朋友圈转载请注明本文转自欧易生物听说点了在看的人，都发了高分文章
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